Eine elektrogenetische Schnittstelle zur Programmierung der Genexpression bei Säugetieren durch Gleichstrom

Naturstoffwechsel (2023)Diesen Artikel zitieren

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Tragbare elektronische Geräte spielen eine immer wichtigere Rolle bei der Erfassung individueller Gesundheitsdaten für personalisierte medizinische Eingriffe. Aufgrund des Fehlens einer direkten elektrogenetischen Schnittstelle können Wearables jedoch noch keine genbasierten Therapien direkt programmieren. Hier schaffen wir das fehlende Glied, indem wir eine elektrogenetische Schnittstelle entwickeln, die wir Direct Current (DC)-actuated Regulation Technology (DART) nennen und die eine elektrodenvermittelte, zeit- und spannungsabhängige Transgenexpression in menschlichen Zellen mithilfe von Gleichstrom aus Batterien ermöglicht. DART nutzt eine Gleichstromversorgung, um ungiftige Mengen reaktiver Sauerstoffspezies zu erzeugen, die über einen Biosensor eine reversible Feinabstimmung synthetischer Promotoren bewirken. In einer Proof-of-Concept-Studie an einem männlichen Mausmodell mit Typ-1-Diabetes stimulierte eine einmal tägliche transdermale Stimulation subkutan implantierter mikroverkapselter gentechnisch veränderter menschlicher Zellen durch aktivierte Akupunkturnadeln (4,5 V Gleichstrom für 10 s) die Insulinfreisetzung und stellte die Normoglykämie wieder her. Wir glauben, dass diese Technologie es tragbaren elektronischen Geräten ermöglichen wird, Stoffwechselinterventionen direkt zu programmieren.

Vernetzte intelligente elektronische Geräte dominieren zunehmend unser tägliches Leben und prägen unser Gesundheitsbewusstsein1; Allerdings funktionieren elektronische und biologische Systeme auf völlig unterschiedliche Weise und sind aufgrund des Fehlens einer funktionierenden Kommunikationsschnittstelle weitgehend inkompatibel. Während biologische Systeme analog sind, genetisch programmiert, durch die Evolution langsam aktualisiert und durch durch isolierte Membranen fließende Ionen gesteuert werden, sind elektronische Systeme digital, durch leicht aktualisierbare Software programmiert und durch durch isolierte Drähte fließende Elektronen gesteuert. Elektrogenetische Schnittstellen, die es elektronischen Geräten ermöglichen würden, die Genexpression zu steuern, bleiben das fehlende Glied auf dem Weg zur vollständigen Kompatibilität und Interoperabilität der elektronischen und genetischen Welt2.

Die synthetische Biologie hat sich dieser Herausforderung gestellt, indem sie einfache analoge Genschalter zu komplexen Genschaltkreisen zusammengefügt hat, die das zelluläre Verhalten mit der Logikverarbeitungsfunktionalität elektronischer Schaltkreise wie Oszillatoren3, Timer4, Speichern5, Bandpassfilter6 und Relaisschalter7 sowie analoger Schaltkreise programmieren können -zu-Digital-Wandler8, Halbaddierer9 und sogar Volladdierer10. Der Nutzen vieler dieser Genschaltkreise wurde bei der experimentellen Kontrolle verschiedener medizinischer Erkrankungen nachgewiesen, darunter Krebs3, bakterielle Infektionen11, chronische Schmerzen12 und Diabetes13. Genschaltkreise beinhalten typischerweise durch Auslöser induzierbare Genschalter, die durch niedermolekulare Verbindungen wie Antibiotika14, Vitamine15, Lebensmittelzusatzstoffe16, Kosmetika17 oder flüchtige Duftstoffe8 gesteuert werden. Da Unterschiede in der Bioverfügbarkeit, pleiotropen Nebenwirkungen und Pharmakodynamik die gesamte regulatorische Leistung solcher Auslöser in einem Säugetierwirt gefährden können, richtet sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf nichtmolekulare, spurlose physikalische Signale wie elektromagnetische Wellen, einschließlich Licht18,19, magnetische Felder20 und Radiowellen21 und Hitze22; Physikalisch ausgelöste Genschalter erfordern jedoch möglicherweise einen hohen Energieaufwand21, können unphysiologische chemische oder anorganische Cofaktoren mit Nebenwirkungen19, schlechter Bioverfügbarkeit23 oder kurzen Halbwertszeiten24 beinhalten, können unter beleuchtungsbedingter Zytotoxizität leiden25 und können durch jede fieberassoziierte Erkrankung beeinträchtigt werden22.

Daher besteht Bedarf an einem Gerät, das eine direkte batteriebetriebene, cofaktorfreie, zeit- und spannungsabhängige elektrische Feinabstimmung der Genexpression bei Säugetieren ermöglicht, um die Voraussetzungen für eine tragbare, elektrogesteuerte Genexpression mit Potenzial zu schaffen medizinische Eingriffe mit einem Internet des Körpers oder dem Internet der Dinge zu verbinden. Bahnbrechende Versuche, eine elektroinduzierbare Genexpression in Bakterien26,27,28,29,30 und Säugetierzellen31,32,33 zu entwickeln, erwiesen sich in Zellkulturen als vielversprechend, waren jedoch aufgrund der Zytotoxizität, der begrenzten Bioverfügbarkeit und der schlechten klinischen Qualität entweder nicht mit In-vivo-Anwendungen kompatibel Kompatibilität elektrosensibler Redoxverbindungen26,31 oder erforderlicher Hochspannungswechselstrom, der durch komplexe bioelektronische Implantate mit begrenzter Lebensdauer gesteuert wird32. Solche Geräte eignen sich nicht für den Einsatz in batteriebetriebenen Wearables zur Programmierung der therapeutischen Transgenexpression in implantierten Zellen32.

Beim Menschen werden reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch Elektronentransferreaktionen während Atmungsprozessen in den Mitochondrien und Peroxisomen, während der mitochondrialen Cytochrom-P450-Aktivität in steroidogenen Geweben und durch NADPH-Oxidase in Immunzellen während Immunreaktionen erzeugt34. Das Kelch-ähnliche ECH-assoziierte Protein 1 (KEAP1) ist ein wichtiger Tumor- und Metastasensuppressor, der auch als nativer ROS-Biosensor fungiert35. Unter Ruhebedingungen bindet KEAP1 den Kernfaktor Erythroid 2 p45-verwandter Faktor 2 (NRF2) und bereitet ihn auf die proteasomale Zerstörung vor35. Bei erhöhtem ROS setzt KEAP1 NRF2 frei, das in den Zellkern wandert, um antioxidative und entzündungshemmende Reaktionen durch Bindung an Antioxidans-Response-Elemente (AREs) zu koordinieren35.

Inspiriert durch die Tatsache, dass Elektroden, die Gleichstrom bei niedriger Spannung liefern, schnell freie Elektronen und Radikalspezies erzeugen können, die zu einer mediatorfreien Produktion von ROS bei niedrigen, nicht zytotoxischen Konzentrationen führen36,37,38, machten wir uns daran, das fehlende Glied für Gleichstrom zu entwerfen -gesteuerte elektrogenetische Zielgenmodulation in menschlichen Zellen, die wir als DC-aktuierte Regulierungstechnologie (DART) bezeichnen. Die auf Gleichstrom basierende Erzeugung von Wasserstoffperoxid wurde kürzlich angewendet, um ein elektrogenetisches System unter Verwendung manipulierter Bakterienzellen, die auf der Oberfläche einer Elektrode wachsen, zu etablieren, das in der Lage war, die Transgenexpression bei elektrischer Stimulation zu aktivieren30. Hier haben wir eine elektrogenetische Schnittstelle entworfen, die aus genetischen Komponenten besteht, die menschliche Zellen auf durch Gleichstrom ausgelöste Elektrostimulation reagieren lassen und eine exklusive, durch Gleichstrom einstellbare Transgenexpression ermöglichen. Wir stellten zunächst fest, dass die ROS-Spiegel, die in menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293) durch 10-sekündige Einwirkung von 4,5 V Gleichstrom erzeugt wurden, nicht ausreichten, um KEAP1/NRF2 wesentlich zu aktivieren; Allerdings könnten die Zellen durch ektopische Expression von nativem KEAP1 und NRF2 gegenüber elektroinduzierten ROS hypersensibilisiert werden. Anschließend ermöglichte die Neuverkabelung von NRF2 mit synthetischen ARE-haltigen Promotoren eine direkte und kofaktorfreie DC-gesteuerte Feinabstimmung der Expression therapeutischer Transgene wie des Insulin-Gens. Als Machbarkeitsnachweis implementierten wir eine DART-basierte Fernsteuerung der Insulinexpression bei Mäusen mit Typ-1-Diabetes. Die Stimulation subkutan implantierter manipulierter Zellen mit von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Akupunkturnadelelektroden bei 4,5 V Gleichstrom für 10 Sekunden einmal pro Tag löste die Produktion von ausreichend Insulin aus, um postprandiale glykämische Schwankungen abzuschwächen und Normoglykämie wiederherstellen.

Um native menschliche Zellen für die elektrostimulierte ROS-vermittelte Transgen-Expressionskontrolle zu sensibilisieren, haben wir menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) mit den konstitutiven Expressionsvektoren KEAP1 (pJH1004, PhCMV-KEAP1-pA) und NRF2 (pJH1003, PhCMV-NRF2-pA) co-transfiziert sowie das Reporterkonstrukt pJH1005 (PDART-SEAP-pA; PDART, OARE-PhCMVmin), das das humane Modellglykoprotein SEAP (humane plazental sekretierte alkalische Phosphatase) unter der Kontrolle eines synthetischen NRF2-abhängigen Promotors kodiert, der eine ARE-Operatorstelle enthält (Supplementary Tabelle 1). Protonen und Chlorionen werden im Zellkulturmedium an den Elektroden erzeugt36,37 (Abb. 1a) und führen zur Produktion von ROS in Mengen38, die die Freisetzung von NRF2 aus KEAP1 auslösen können, was zur NRF2-vermittelten Expression eines Gens von führt Interesse vom NRF2-spezifischen synthetischen PDART-Promotor (Abb. 1b).

a, Schematische Darstellung des Stimulationsaufbaus für Monoschichtkulturen. Jede Vertiefung einer 24-Well-Platte verfügt über zwei Platindrähte, die als Anode und Kathode fungieren und im Abstand von 0,6 cm in das Kulturmedium eingetaucht sind. Wenn elektrischer Strom angelegt wird, bilden sich Blasen um die Elektroden herum, wobei an der Anode Chlorgas und an der Kathode Wasserstoffgas entsteht. b, Schematische Darstellung des elektrogenetischen Kreislaufs basierend auf der antioxidativen Reaktion von NRF2/KEAP1. Bei elektrischer Stimulation wird die Bildung von ROS durch konstitutiv exprimierte NRF2- und KEAP1-Komplexe im Zytoplasma erfasst, was die Translokation von NRF2 in den Zellkern auslöst, wo es die Expression des interessierenden Gens durch Bindung an ARE-Stellen in der vorgeschalteten Synthese aktiviert Promoter. Unter nicht stimulierenden Bedingungen wird NRF2 kontinuierlich zum 26S-Proteasom zum Abbau geleitet. c, SEAP, produziert von transient transfizierten HEK293-Zellen (KEAP1, pJH1004; NRF2, pJH1003; PDART-SEAP, pJH1005) nach Stimulation durch Gleichstrom mit 10 V für 15 s (DC10 V) und 5 V für 20 s (DC5 V). d, SEAP, produziert von Zellen, die nur mit ARE-Reporter (PDART-SEAP, pJH1005) oder zusammen mit KEAP1- (pJH1004) und NRF2-Varianten (Wildtyp-NRF2, pJH1003; NRF2-VP64, pJH1175) und Reporter (pJH1005) transfiziert wurden. Die Zellen wurden 20 s lang mit DC5V stimuliert. e, SEAP, produziert von Zellen, die mit KEAP1 (pJH1004), NRF2, fusioniert mit dem Tetracyclin-abhängigen Transaktivator TetR-VP64 (NRF2-TetR-VP64, pJH1181) und dem verwandten Reporter (PTRE-SEAP-pA, pMF111) co-transfiziert wurden. Die Zellen wurden 20 s lang mit DC5V stimuliert. f, SEAP, produziert von Zellen, die mit Reporterkonstrukten cotransfiziert wurden, die eine (DART1), zwei (DART2), drei (DART3) und vier (DART4) ARE-Wiederholungen in der Promotorregion enthalten und 20 s lang mit DC5V stimuliert wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 4. P-Werte wurden zwischen stimulierten und nicht stimulierten Kontrollen berechnet.

Quelldaten

Zur Elektrostimulation wurden die manipulierten Zellen in Standardplatten mit 24 Vertiefungen kultiviert, die maßgeschneiderte Deckel enthielten, die dazu dienten, 0, 5-mm-Platinelektroden in einem Abstand von 6 mm in das Kulturmedium einzutauchen (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a, b und ergänzende Abbildungen). Video 1). Wir beobachteten eine signifikant erhöhte SEAP-Expression bei Elektrostimulation mit Gleichstrom bei 10 V für 15 s oder 5 V für 20 s (Abb. 1c). Wechselstrom-Pulsprogramme (AC), die ähnliche Energie wie diese DC-Programme liefern (z. B. 1-ms-Pulse von 5 V bei 1 Hz während 2,78 Stunden), führten zu einem weniger als zweifachen Anstieg der SEAP-Expression und einer deutlich verringerten Zelllebensfähigkeit ( Ergänzende Abbildungen 1c–f und 2). Um vergleichbare SEAP-Expressionsniveaus zu erreichen, muss die AC-Stimulation tatsächlich mehr Energie liefern und über längere Zeiträume laufen (6 Stunden für 1-ms-Impulse (ergänzende Abbildung 2c) oder über 1 Stunde für 10-ms-Impulse (ergänzende Abbildung). 2e)), wiederum mit negativen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen (Ergänzende Abbildungen 1c – f und 2). Deshalb haben wir uns im Folgenden auf Gleichstrom als unsere einzige Energiequelle konzentriert. Bemerkenswerterweise hatten Gleichstromstimulationsprogramme unter 5 V und 20 s keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen (Ergänzungsabbildungen 2 und 3a), die Mediumzusammensetzung (Ergänzungsabbildungen 3b – e und Ergänzungstabellen 2–5), die Wachstumskinetik oder die gesamte Proteinproduktionskapazität von stimulierten Zellen (ergänzende Abbildung 4), was darauf hinweist, dass die DC-vermittelte Elektrostimulation tatsächlich spezifisch auf DART-Promotoren umgeschaltet werden kann, um die Transgenexpression in menschlichen Zellen zu optimieren. Elektrostimulierte HEK293-Zellen, die ausschließlich mit pJH1005 transfiziert wurden, zeigten eine wesentlich geringere SEAP-Induktion, was darauf hinweist, dass die gleichzeitige Koexpression von KEAP1 und NRF2 die Empfindlichkeit der menschlichen Zellen gegenüber der elektrostimulierten ROS-Produktion erhöht (Abb. 1d). Wir haben auch getestet, ob NRF2, das mit der starken Transaktivierungsdomäne VP64 fusioniert ist, die auf vier Tandem-Wiederholungen des frühen Transkriptionsaktivators VP16 des Herpes-simplex-Virus (pJH1175, PhCMV-NRF2-VP64-pA) basiert, die elektrostimulierte Reaktion weiter verstärken könnte; Diese Modifikation erhöhte jedoch sowohl die basale als auch die elektrostimulierte SEAP-Expression, was zu einer wesentlich geringeren Gesamtinduktionsfalte (3,7 ×) im Vergleich zu nativem NRF2 (7,2 ×) führte (Abb. 1d). Ebenso beobachteten wir eine geringere Induktion (3,9-fach) von NRF2, fusioniert mit dem Tetracyclin-abhängigen Transaktivator TetR-VP64 (pJH1181, PhCMV-NRF2-TetR-VP64-pA), wodurch die SEAP-Expression von einem Promotor aus aktiviert wurde, der Tetracyclin-Response-Elemente (TRE) enthielt. (pMF111, PTRE-SEAP-pA; PTRE, OTetR-PhCMVmin) (Abb. 1e). Weitere Analysen mit PDART-Varianten, die verschiedene ARE-Tandem-Wiederholungen enthielten, ergaben, dass eine einzelne ARE-Wiederholung eine niedrige Basalexpression, aber auch das niedrigste maximale Expressionsniveau lieferte, während mehr Tandem-Wiederholungen wesentlich höhere maximale Expressionsniveaus auf Kosten einer höheren Basalexpression erreichten (Abb. 1f). . Daher bestimmt die Priorität für entweder die niedrigste Leakiness oder das höchste Expressionsniveau die Auswahl der PDART-Varianten, wie dies auch bei anderen Modalitäten der Transkriptionskontrolle der Fall ist39.

Ein fluoreszenzbasierter Assay zeigte, dass die intrazellulären ROS-Spiegel 1 Stunde nach 20 s langer Gleichstrom-Elektrostimulation bei 5 V um mehr als das Doppelte anstiegen und innerhalb von 6 Stunden wieder auf nicht-stimulierte Werte zurückkehrten, was darauf hindeutet, dass die elektrostimulierte SEAP-Expression tatsächlich durch ROS36 vermittelt wurde. 37,38 (Erweiterte Daten Abb. 1a). Bemerkenswert ist, dass Zellen, die mit dem ROS-Fänger N-Acetyl-L-Cystein (NAC)40 behandelt wurden, die SEAP-Expression bei Elektrostimulation nicht erhöhten (Extended Data Abb. 1b, c). Im Gegensatz dazu könnten Zellen, die mit Inhibitoren verschiedener ROS-erzeugender Enzyme wie GKT136901, AEBSF, ML171 und VAS2870 (Lit. 41) behandelt wurden, immer noch auf Elektrostimulation reagieren, indem sie die SEAP-Expression erhöhen (Extended Data Abb. 1b, c), was dies unterstützt sind der Ansicht, dass die ROS-Erzeugung eher auf die Gleichstromstimulation als auf endogene Quellen zurückzuführen ist. Obwohl Wasserstoffperoxid (H2O2), Oltipraz, Diquatdibromid42 und Aspirin43 ROS-Anstiege in Zellen auslösen können, zeigte das DART-System darüber hinaus keine SEAP-Reaktion auf diese Chemikalien (Extended Data Abb. 2), was darauf hindeutet, dass DART nicht auf die freien Radikale reagiert durch diese Chemikalien erzeugt (z. B. Hydroxylradikale (•OH) aus der H2O2-Behandlung44). Umgekehrt erzeugt die Gleichstrom-Elektrostimulation freie Elektronen, die von verschiedenen Molekülen aufgenommen werden können, um ein breiteres Spektrum an Radikalen zu bilden. Einige von ihnen können das DART-System auslösen, indem sie die Transgenexpression durch den synthetischen PDART-Promotor aktivieren. Wir analysierten auch den resultierenden Strom, die ROS-Werte, die SEAP-Reaktion und den Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen, als die angelegten Gleichspannungen in einem Drei-Elektroden-Aufbau mit integrierter Ag/AgCl-Referenzelektrode gemessen wurden, und demonstrierten so die Abstimmbarkeit des DART-Systems in vitro ( Erweiterte Daten Abb. 3). Die Sequenzierung der nächsten Generation ergab, dass die Gleichstrom-Elektrostimulation bei 5 V für 10 s einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Transkriptomebene hatte, 5 V für 25 s jedoch einen leichten Effekt hatten, wobei ein kleiner Satz von Genen, die hauptsächlich mit der antioxidativen Reaktion verbunden sind, im Vergleich zu nicht-exprimierten Genen unterschiedlich exprimiert wurden -stimulierte Zellen (Erweiterte Daten Abb. 4 und Ergänzungsliste). Diese Ergebnisse zeigen, dass Stimulationszeiten <25 s die DART-Kontrolle nicht beeinträchtigen und alle Folgeexperimente entsprechend durchgeführt wurden.

Die Profilierung der Transgen-Expressionsniveaus nach spannungsabhängiger Gleichstrom-Elektrostimulation für 15 Sekunden ergab ähnliche Expressionsniveaus zwischen 5 und 12, 5 V, wohingegen höhere Spannungen höhere ROS-Werte erzeugten, die die Lebensfähigkeit der Zellen verringerten (Abb. 2a und ergänzende Abb. 5a). Mit der auf 5 V eingestellten Gleichstromleistung konnte das Expressionsniveau des Zielgens präzise eingestellt werden (Abb. 2b und ergänzende Abb. 5b, c) und es wurden unterschiedliche Induktionsprofile über längere Zeiträume aufrechterhalten (Abb. 2c). Die korrelierende Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopanalyse des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins zeigte keine wesentliche Undichtigkeit des DART-Systems (ergänzende Abbildung 5d – f und ergänzende Videos 2 und 3). Dennoch verringerten Expositionszeiten über 30 s sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen als auch die SEAP-Expression erheblich (ergänzende Abbildung 5g, h), was wahrscheinlich auf Gasblasen und pH-Änderungen an den Elektroden zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung 6a – e). Die Induktionskinetik zeigte innerhalb von 4 Stunden ein signifikantes Maß an elektrostimulierter Proteinproduktion im Kulturüberstand (Abb. 2d), was mit dem Verhalten professioneller sekretorischer Zellen übereinstimmt32. Darüber hinaus war die mit Gleichstrom betriebene Transgen-Expressionskontrolle vollständig reversibel und zeigte ähnliche Induktions- und Repressionsprofile über mehrere Zyklen des Umschaltens von EIN auf AUS und AUS auf EIN (Abb. 2e).

a,b, SEAP-Spiegel 24 Stunden nach der elektrischen Stimulation in Kulturüberständen von HEK293-Zellen, die mit den DART-Konstrukten (pJH1003, pJH1004 und pJH1005) co-transfiziert wurden. Stimulation für 15 s bei den angegebenen Spannungen (a) oder mit 5 V DC für die angegebenen Zeiträume (b). c, SEAP-Produktionskinetik über 72 Stunden durch manipulierte Zellen, die für die angegebenen Zeiträume 5 V Gleichstrom ausgesetzt waren. Die Induktionsfaktoren wurden zwischen der stimulierten und der nicht stimulierten Gruppe nach 25 s berechnet. d, SEAP, das innerhalb von 6 Stunden von DART-technisch hergestellten Zellen nach 20-sekündiger Einwirkung von 5 V Gleichstrom erzeugt wird. Die Induktionsfaktoren wurden zwischen den angegebenen Gruppen berechnet. e, Reversibilität des DART-Schalters. Gentechnisch veränderte Zellen wurden abwechselnd für 24-Stunden-Zyklen in Medium ohne Elektrostimulation (AUS) kultiviert oder 20 Sekunden lang mit 5 V Gleichstrom behandelt (AN) und die SEAP-Produktion wurde in den Kulturüberständen gemessen. Alle 24 Stunden wurde das Kulturmedium ausgetauscht und die Zelldichte neu eingestellt. f, SEAP, produziert von verschiedenen Säugetierzelllinien, die vorübergehend mit den DART-Konstrukten transfiziert und 20 s lang mit 5 V Gleichstrom stimuliert wurden. Als Kontrollen wurden nicht stimulierte Kulturen verwendet. Alle Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 4. P-Werte wurden zwischen stimulierter und nicht induzierter Kontrolle berechnet. Statistische Bezeichnungen mit unterschiedlichen Farben beziehen sich auf die entsprechenden Datenpunkte mit derselben Farbe (c).

Quelldaten

Um die Vielseitigkeit des DART-Systems weiter zu beurteilen, haben wir vorübergehend eine Reihe von Säugetierzelllinien transfiziert (Abb. 2f). Trotz Schwankungen in der Transfektionseffizienz11 und der ROS-Empfindlichkeit, die zu unterschiedlichen Faltinduktionen und maximalen Expressionsniveaus führten, wurde die DART-Funktionalität in allen getesteten Zelllinien, einschließlich der aus menschlichen mesenchymalen Stammzellen abgeleiteten Zelllinie (hMSC-TERT), validiert, was darauf hindeutet, dass DART dies auch tun wird kompatibel mit einer Vielzahl von Anwendungen (Abb. 2f und ergänzende Abb. 6f). Unter Berücksichtigung der Faltinduktion sowie der basalen und maximalen Expressionsniveaus wählten wir HEK293- und hMSC-TERT-Zellen für die Verwendung in Folgeexperimenten aus (Abb. 2f).

Um die Eignung weit verbreiteter Gleichstromquellen sowie die Kompatibilität mit tragbaren und tragbaren elektronischen Geräten zu überprüfen, untersuchten wir als Nächstes die Elektrostimulation der Genexpression mit handelsüblichen Gleichstromquellen wie Alkalibatterien, Knopfzellen, mobilen Ladegeräten und tragbaren Geräten Powerbanks. Wir haben zunächst eine, zwei und drei 1,5-V-AA- und AAA-Batterien getestet, die in Reihe geschaltet jeweils 1,5, 3 und 4,5 V liefern. Obwohl Spannungen <3 V längere Induktionszeiten von 2–60 Minuten erforderten, um ausreichend ROS zu erzeugen, um signifikante SEAP-Werte auszulösen, reichte eine 10-sekündige Stimulation mit drei AA- oder drei AAA-Batterien aus, um die SEAP-Expression zu induzieren, die nach 25 s Stimulation ihren Höhepunkt erreichte ( Abb. 3a–c und erweiterte Daten Abb. 5a–c), die Induktionsprofile zeigen, die mit denen einer 5-V-Stromversorgung vergleichbar sind.

Wechselstrom, eine (a), zwei (b) und drei (c) Duracell- oder Energizer-Alkali-AA-Batterien mit 1,5 V. d, Zwei Duracell- oder Energizer-Lithium-Knopfzellen (CR2032) liefern etwa 6 V. e, Eine Duracell- oder Energizer-9-V-Block-Alkalibatterie. f, eine A220/504 A Exell-Batterie. Die SEAP-Werte wurden 24 Stunden nach der Stimulation gemessen. Alle Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 4. P-Werte wurden zwischen stimulierter und nicht induzierter Kontrolle berechnet.

Quelldaten

Die 3-V-Lithium-Knopfzellenbatterie CR2032, die häufig zum Antrieb tragbarer Geräte verwendet wird, löste die SEAP-Expression in bis zu 30 Minuten aus, während eine 6-V-Reihenschaltung aus zwei CR2032-Batterien die SEAP-Expressionsspitzenwerte in <20 s programmierte (Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 5d). Darüber hinaus erzeugte ein 6-V-Reihenaufbau, der mit vier AA- oder vier AAA-Batterien betrieben wurde, Proteinexpressionsprofile, die mit denen der 2 × CR2032-Konfiguration vergleichbar waren, was die Spannungsabhängigkeit des elektrogenetischen Genschalters unabhängig von der Art der Stromquelle bestätigte ( Erweiterte Daten Abb. 5e,f). Dies wurde weiter durch die Verwendung eines Mobiltelefonladegeräts und einer Powerbank bestätigt, die normalerweise einen 5-V-Ausgang liefern (Extended Data Abb. 5g,h).

Wir haben auch Batterien mit höherer Spannung getestet, darunter 9-V-Block-, 12-V-23-A-Alkalibatterien und 15-V-Exell-A220-504-A-Batterien einzeln (Abb. 3e,f und erweiterte Daten, Abb. 5i) oder in Reihe geschaltet im Tandem (erweiterte Daten, Abb . 5j–l) Konfigurationen. Messungen der SEAP-Expression bestätigten eine umgekehrte Korrelation zwischen der Spannung (1,5–30 V) und den Zeiten des Spitzenexpressionsniveaus (5 s bis 60 min) über alle Gleichstromquellen (Abb. 3e, f und erweiterte Daten Abb. 5i – l). Vor allem hatte keine der getesteten Batteriekonfigurationen einen wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen während der angegebenen Stimulationszeiten (Ergänzende Abbildungen 7 und 8), was bestätigt, dass die mit Gleichstrom betriebene elektrogenetische Schnittstelle robust, sicher und über einen weiten Bereich von Spannungen und Batterietypen abstimmbar ist und Stimulationszeiten.

Als anspruchsvollen In-vivo-Proof-of-Principle haben wir uns für die Behandlung von experimentellem Typ-1-Diabetes (T1D) entschieden, da es sich bei Diabetes um eine chronische Krankheit handelt, deren Prävalenz weltweit dramatisch zunimmt und die ein dynamisch anspruchsvolles Management erfordert45. Für die DC-sensitive Steuerung der Insulinproduktion und -freisetzung haben wir stabile HEK293- und hMSC-TERT-Zelllinien etabliert, die für die konstitutive Expression von KEAP1 (ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR, pJH1054) und NRF2 (ITR-PhCMV) entwickelt wurden -NRF2-pA:PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR, pJH1101) und NRF2-abhängige Expression von Insulin (ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS-pA:PmPGK-ZeoR-pA-ITR, pJH1169, PDART4 , OARE4-PhCMVmin) (Erweiterte Daten Abb. 6a). Um den dynamischen Bereich der Insulinexpression zu maximieren, verwendeten wir die synthetische Promotorvariante PDART4, die vier Tandem-ARE-Operatorstellen enthält (Abb. 1f). Mehrere monoklonale Zelllinien wurden für die DC-kontrollierte Insulinexpression und den besten hMSC-TERT-Zellklon DCINS seiner Klasse profiliert (Extended Data Abb. 6b, c), der im Vergleich zu vorübergehend transfizierten isogenen Zellen eine verbesserte elektrostimulierte Insulinfalteninduktion und -freisetzung zeigte Populationen (Extended Data Abb. 6c) wurden für die Behandlung von experimentellem T1D ausgewählt. Wir haben durch qPCR und Western Blot bestätigt, dass die DCINS-Zelllinie im Vergleich zur Elternzelllinie erhöhte Mengen an KEAP1- und NRF2-Transkripten und -Proteinen aufwies (Extended Data Abb. 6d – g). Die Stimulation von DCINS-Zellen mit 4,5 V Gleichstrom aus drei AA-Batterien für Expositionszeiten zwischen 5 s und 25 s konnte die Expressionsniveaus von SEAP (Abb. 4a) und Insulin (Abb. 4b) präzise regulieren und unterschiedliche Induktionsprofile wurden über längere Zeiträume aufrechterhalten (Abb. 4c). Die Untersuchung der Induktionskinetik ergab, dass die elektrostimulierte Proteinproduktion im Kulturüberstand innerhalb von 3 Stunden ein signifikantes Niveau erreichte (Abb. 4d), was schneller ist als bei vorübergehend transfizierten Zellen (Abb. 2d). Darüber hinaus zeigten die DCINS-Zellen eine hervorragende Reversibilität der SEAP- (Abb. 4e) und Insulin- (Abb. 4f) Expression als Reaktion auf EIN-AUS-EIN- oder AUS-EIN-AUS-Stimulationsmuster in 24-Stunden-Intervallen.

a,b, SEAP- (a) und Insulinspiegel (b) in Kulturüberständen der monoklonalen DCINS-Zellen, die das DART-System 24 Stunden nach der elektrischen Stimulation stabil enthalten. Die Spannung zur Stimulation der Zellen wurde für die angegebenen Zeiträume von drei AA-Batterien (4,5 V Gleichstrom) bereitgestellt. c, SEAP-Produktionskinetik während 72 Stunden nach der Exposition von DCINS-Zellen bei 4,5 V Gleichstrom für die angegebenen Zeiträume. Die Induktionsfaktoren wurden zwischen der nicht stimulierten und der stimulierten Gruppe nach 25 s berechnet. d, SEAP, produziert während der ersten 2, 3 und 6 Stunden von DCINS-Zellen, die nicht stimuliert wurden oder 20 Sekunden lang mit 4,5 V Gleichstrom stimuliert wurden. Die Induktionsfaktoren wurden zwischen den angegebenen Gruppen berechnet. e,f, Reversibilität von DCINS-Zellen, die SEAP (e) und Insulin (f) exprimieren. DCINS-Zellen wurden abwechselnd für 24-Stunden-Zyklen in Medium kultiviert, das 20 Sekunden lang mit 5 V Gleichstrom (EIN) oder ohne Elektrostimulation (AUS) behandelt wurde. Zur Analyse der SEAP- und Insulinproduktion wurden alle 12 Stunden Kulturüberstandsproben entnommen. Das Kulturmedium wurde alle 24 Stunden ausgetauscht und die Zelldichte neu angepasst. Alle Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 4. Der P-Wert gibt die Signifikanz der Unterschiede in den Mittelwerten an; angegebene Gruppe im Vergleich zur nicht stimulierten Gruppe (a,b,d). Die statistischen Bezeichnungen mit unterschiedlichen Farben beziehen sich auf die entsprechenden Datenpunkte mit derselben Farbe (c).

Quelldaten

Da für die durch Gleichstrom elektrostimulierte DART-gesteuerte Insulinexpression keine komplexe Steuerelektronik erforderlich ist, verwendeten wir einen dreifachen AA-Batteriesatz mit 4,5 V Gleichstrom, der über einen einfachen manuellen EIN/AUS-Schalter mit zwei maßgeschneiderten platinierten Akupunkturnadeln verbunden war (ergänzende Abbildung 9a). –i und Ergänzungstabelle 6) im Abstand von 6 mm an der Implantationsstelle angeordnet, um DCINS zu stimulieren, das subkutan auf dem Rücken von Typ-1-Diabetikermäusen implantiert wurde (Abb. 5a, b). Vor der Implantation haben wir bestätigt, dass die in klinisch zugelassenem semipermeablem Alginat mikroverkapselten DCINS-Zellen bei Stimulation mit 4, 5 V Gleichstrom eine präzise zeitabhängige Insulinfreisetzung zeigten (ergänzende Abbildung 9j). Um zu bestätigen, dass Insulin als Reaktion auf die direkte Elektrostimulation implantierter Zellen produziert und abgesondert wird, verwendeten wir eine negative Kontrollgruppe mit ähnlicher dorsaler Implantation, die jedoch mit Akupunkturnadeln stimuliert wurde, die 3 cm von der Implantationsstelle entfernt platziert waren. In der behandelten Gruppe schwächte eine einzelne 4,5-V-Elektrostimulation für 10 Sekunden pro Tag die Nüchternglykämie innerhalb von 2 Tagen ab und die Normoglykämie wurde über den gesamten Behandlungszeitraum von 4 Wochen wiederhergestellt (Abb. 5c). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurden die Werte des glykierten Hämoglobins (HbA1c) bei elektrostimulierten T1D-Mäusen über einen Zeitraum von fünf Behandlungswochen abgeschwächt und erreichten ähnliche Werte wie bei Wildtyp-Mäusen (Erweiterte Daten, Abb. 7a). Im Gegensatz dazu blieben die Tiere bei der Stimulation von T1D-Mäusen mit zwei elektrisch leitenden Klebepflastern, die an der Implantationsstelle anstelle der platinierten Akupunkturnadeln befestigt wurden, genauso hyperglykämisch wie nicht stimulierte T1D-Mäuse, was darauf hindeutet, dass diese Stimulationsmethode die Insulinproduktion von implantierten DCINS-Zellen nicht auslösen kann (Erweiterte Daten Abb. 7b,c). Wir untersuchten auch, wie Mäuse auf die Akupunkturnadelstimulation reagierten, wenn sie mit NAC (ROS-Scavenger) oder Inhibitoren von ROS-erzeugenden Enzymen vorbehandelt wurden. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Ergebnissen hob nur NAC die Wirkung der Elektrostimulation auf, wobei Mäuse ähnliche Blutzucker- und Insulinspiegel aufwiesen wie nicht stimulierte Mäuse (Extended Data Abb. 7d, e). Die makroskopische Untersuchung der Implantationsstelle 4 Wochen nach der Transplantation ergab keine offensichtlichen Unterschiede zwischen stimulierten und nicht stimulierten Mäusen oder im Vergleich zu nicht transplantierten Wildtyp-Mäusen (ergänzende Abbildung 10a – c). Um zu bestätigen, dass die Stimulation keine Auswirkungen auf umliegendes Gewebe hat, analysierten wir Gewebe neben der Elektrodenstelle stimulierter und nicht stimulierter Mäuse gemäß ISO 10993-6 (Ref. 46). Wir beobachteten keine material- oder elektrostimulationsbedingte Zytotoxizität und keine nennenswerte lokale Immunantwort um die Implantationsstelle (Ergänzungsabbildung 10d – g und Ergänzungstabelle 7). Es gab keinen offensichtlichen histopathologischen Unterschied zwischen den elektrodenhaltigen, nicht stimulierten und elektrodenhaltigen, elektrisch stimulierten Gruppen (Ergänzungsabbildung 10d – g und Ergänzungstabelle 7). Auch die Profilierung von Entzündungsmediatoren im Serum nicht-stimulierter und elektrostimulierter Gruppen zeigte keine signifikanten Unterschiede (Extended Data Abb. 8a–c). Außerdem hatte die kurze Elektrostimulation keinen offensichtlichen Einfluss auf den Blut-pH-Wert (Extended Data Abb. 8d). Glukosetoleranztests (GTTs) ergaben, dass die elektrostimulierte Insulinproduktion und -freisetzung nicht nur die Glukosehomöostase wiederherstellte, sondern auch die postprandiale glykämische Abweichung im Vergleich zu Negativkontrollgruppen ohne Implantat, mit nicht stimulierten Implantaten oder mit Implantaten, aber entfernter Elektrostimulation abschwächte (Abb. 5d und erweiterte Daten Abb. 8e). Die glykämische Kontrolle war vollständig reversibel, wenn der Elektrostimulationsstatus in 3-Tage-Intervallen von AUS auf EIN oder von EIN auf AUS umgeschaltet wurde (Abb. 5e). Elektrostimulierte Tiere hatten signifikant höhere Blutinsulinspiegel als die Kontrollgruppen, was bestätigt, dass die durch Gleichstrom betriebene Induktion der Insulinproduktion und -sekretion tatsächlich die Glukosehomöostase bei Mäusen mit Typ-1-Diabetes wiederherstellte (Abb. 5f). Darüber hinaus haben wir mehrmals täglich 24 Stunden nach der Elektrostimulation mit 4,5 V Gleichstrom für 10 Sekunden ein Profil des Blutzuckerspiegels erstellt und keine hypo- oder hyperglykämischen Episoden beobachtet (Abb. 5g). In Übereinstimmung mit diesem Befund ergab die Zeitverlaufsanalyse anderer Biomarker für Insulinmangel, nämlich Insulin, Ketone, Triglyceride und Glucagon, keine signifikanten Unterschiede zwischen elektrostimulierten T1D-Mäusen und Wildtyp-Tieren, wohingegen diese Biomarker deutlich niedriger waren (Insulin). und höher (Ketone, Triglyceride und Glucagon) bei nicht stimulierten T1D-Mäusen (Extended Data Abb. 9).

a, Schema, das zeigt, wie verkapselte, mit DART hergestellte Zellen, die in den Rücken von Mäusen implantiert werden, stimuliert werden. b, Bild, das die maßgeschneiderten Akupunkturnadeln zeigt, die an die Alkalibatterien angeschlossen sind. c: Die Nüchternglykämie wurde vor der Implantation (Tag 0) und vier aufeinanderfolgende Wochen nach der Implantation in drei Gruppen von T1D-Mäusen mit DCINS-Zellimplantaten aufgezeichnet, nämlich nicht stimulierten Mäusen, Mäusen, die 10 Sekunden lang an der Implantationsstelle stimuliert wurden (stimuliert) und Mäusen mit Zellimplantaten, die 10 s lang mit Elektroden stimuliert wurden, die 3 cm von der Implantationsstelle entfernt auf dem Rücken angebracht waren (fernstimuliert). Als Kontrollen dienten auch Wildtyp-Mäuse und T1D-Mäuse ohne Implantate. d: Eine intraperitoneale GTT wurde an Mäusen 3 Tage nach der Implantation mikroverkapselter Zellen und nach 8-stündigem Fasten durchgeführt. e, Reversibilität der DART-vermittelten Blutzuckerkontrolle. Mikroverkapselte Zellen wurden an der Implantationsstelle perkutan elektrostimuliert, wobei die EIN-AUS/AUS-AN-Stimulation jeden dritten Tag umgekehrt wurde, wobei 4,5 V Gleichstrom für 10 s als EIN verwendet wurden. f: Die Blutinsulinspiegel von nicht-stimulierten und elektrostimulierten Tieren wurden 1, 2, 3 und 4 Wochen nach der Implantation profiliert. Stimulierte und entfernt stimulierte Gruppen (3 cm von der Implantationsstelle entfernt) wurden 10 s pro Tag mit 4,5 V Gleichstrom behandelt (c,f). g, Blutzuckerschwankungen am Tag 4 nach der Implantation. Zu mehreren Zeitpunkten wurden Blutproben zur Analyse von Glukose bei Wildtyp-Mäusen und T1D-Mäusen entnommen, die nicht stimuliert und 10 s lang mit 4,5 V Gleichstrom stimuliert wurden. Der Zeitpunkt Null entsprach Mitternacht und die Elektrostimulation wurde um 6:00 Uhr durchgeführt. Alle Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 5; Die Werte wurden auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert. Das Experiment wurde einmal in g durchgeführt. P-Werte geben die Signifikanz von Unterschieden in den Mittelwerten an; stimulierte Gruppe versus nicht stimulierte Gruppe (blau) oder Wildtyp-Gruppe (schwarz) (c,d); stimulierte Gruppe versus nicht stimulierte Gruppe (g); zwei Gruppen gegeneinander (e); und stimulierte Gruppe im Vergleich zur angegebenen Gruppe (f).

Quelldaten

Um die Einstellbarkeit des DART-Systems in vivo zu beurteilen, stimulierten wir T1D-Mäuse über verschiedene Zeiträume (zwischen 5 und 15 s) mit zwei bis fünf AA-Batterien und einer 9-V-Blockbatterie als Stromquellen und lieferten 3, 4,5, 6, 7,5 bzw. 9 V Gleichstrom. Wir beobachteten eine spannungsabhängige sowie zeitabhängige Einstellbarkeit von Blutzucker (Abb. 6a, b) und Blutinsulin (Abb. 6c, d) sowie eine damit einhergehende Feinabstimmung anderer Biomarker für Insulinmangel, Ketone, Triglyceride und Glucagon (Extended Data Abb. 10a–f), was zeigt, dass die metabolische Homöostase durch Anlegen einer 4,5-V-Elektrostimulation für 10 s oder länger wiederhergestellt werden kann (Abb. 6b, d) und die Bestätigung der In-vitro-Abstimmbarkeit von DART-transgenen Zellen (Abb. 2b, c und 4a – c, erweiterte Datenabbildungen 3g, h und 7j und ergänzende Abbildung 5c).

a–d, Blutzuckerspiegel (a,b) und Insulinspiegel (c,d) von T1D-Mäusen mit DCINS-Zellimplantaten, die 5 s lang mit unterschiedlichen Spannungen (3, 4,5, 6, 7,5 und 9 V) elektrostimuliert wurden (a,c) und für verschiedene Zeiträume (0, 5, 10 und 15 s) bei 4,5 V (b,d). Die Spannungen wurden mit zwei bis fünf AA-Batterien bzw. einer 9-V-Blockbatterie angelegt. Als Kontrollen dienten T1D- und Wildtyp-Mäuse ohne jegliche Behandlung. Die Blutproben wurden nach 6-stündigem Fasten entnommen. Die entsprechenden Blutprofile der Biomarker für Insulinmangel, Ketone, Triglyceride und Glucagon sind in Extended Data Abb. 10a–f, Zeitreihen-Überwachung von Blutzucker (e) und Insulin (f) am Tag 4 nach der Implantation bei T1D-Mäusen ohne einmal, zweimal, drei- oder viermal pro Tag mit DC 4,5 V für 10 s gemäß dem Schema in Extended Data Abb. 10g stimuliert bzw. stimuliert. Die entsprechenden Blutprofile der Biomarker für Insulinmangel, Ketone, Triglyceride und Glucagon sind in den erweiterten Daten Abb. 10h–j dargestellt. Alle Daten sind Mittelwerte ± SD; n = 5; Das Experiment wurde einmal durchgeführt und die Werte wurden auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert. Der P-Wert gibt die Signifikanz von Unterschieden in den Mittelwerten an. Statistische Bezeichnungen mit unterschiedlichen Farben beziehen sich auf die entsprechenden Datenpunkte mit derselben Farbe (e,f).

Quelldaten

Schließlich untersuchten wir, wie das implantierte DART-System auf bis zu vier Elektrostimulationen pro Tag reagiert, um die Notwendigkeit mehrerer täglicher Insulininjektionen bei einigen Patienten mit Typ-1-Diabetes nachzuahmen. Um das Muster beim Menschen nachzuahmen, planten wir für die Mäuse über den Tag verteilt wiederholte Fasten-Fütterungs-Zyklen (Extended Data Abb. 10g). In allen elektrostimulierten Gruppen schwankten die Glukose- und Insulinspiegel um die Wildtyp-Spiegel und zeigten zu jedem Zeitpunkt signifikante Unterschiede zur nicht stimulierten Gruppe (Abb. 6e, f). Um eine umfassende Beurteilung des Diabetesstatus aller Gruppen zu ermöglichen, haben wir tagsüber alle 3 Stunden Blutproben entnommen und auf Ketonkörper, Triglyceride und Glucagon getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Elektrostimulationspläne, von einem bis vier pro Tag, den glykämischen Zustand diabetischer Mäuse signifikant verbesserten (Extended Data Abb. 10h–j).

DART bietet eine reversible und abstimmbare elektrogenetische Schnittstelle, die von einfachen, leicht verfügbaren Niederspannungs-Gleichstromquellen betrieben wird, wie z. B. Batterien, die häufig zur Stromversorgung tragbarer oder tragbarer elektronischer Geräte verwendet werden18,47. Bemerkenswert ist, dass DART sehr wenig Leistung und Gesamtenergie benötigt, um die Zielgenexpression zu kontrollieren. Da eine einzelne elektrische Stimulation mit zwei Elektroden im Abstand von 6 mm für nur 10 s ausreicht, um die Produktion und Freisetzung von ausreichend täglichem Insulin auszulösen, schätzen wir die für eine tägliche Insulinspritze erforderliche elektrische Gleichstromleistung auf etwa 0,06 W, was eine einfache 4,5-V-Triple-AA-Batteriesatz für eine Betriebsdauer von mehr als 5 Jahren und gleichzeitige Bereitstellung einer täglichen therapeutischen Dosis. Prinzipiell könnten die Betriebszeiten weiter optimiert werden, indem der Widerstand durch Verringerung des Elektrodenabstands verringert wird oder, wie wir gezeigt haben, durch den Einsatz von Akkupacks mit höherer Spannung und höherer Kapazität noch kürzere Induktionszeiten erreicht werden. Darüber hinaus erfordert die Steuerung von DART nur einen einfachen manuellen elektrischen EIN/AUS-Schalter. Da DART zudem manipulierte Zellen direkt stimulieren kann, die in von der US-amerikanischen FDA zugelassenen Alginat-Mikrobehältern mikroverkapselt sind, die klinisch für die Transplantation menschlicher Inseln48 zugelassen und validiert sind48, über von der WHO und der US-amerikanischen FDA zugelassene Akupunkturnadeln49, ist die Fernbedienung einfach und erfordert keine die Verwendung komplexer, fehleranfälliger bioelektronischer Implantate, deren Betrieb in einer Gewebeumgebung besonders schwierig ist32. Tatsächlich beruhte unser erstes elektrogenetisches Zellimplantat auf der Sensibilisierung der Zellen gegenüber elektrischen Feldern durch die Koexpression zweier Ionenkanäle, die mit endogenen Signalkaskaden verbunden sind, und auf der Einkapselung der Zellen in einem komplexen, drahtlos betriebenen bioelektronischen Implantat, das durch Wechselstrom bei Hochspannung aktiviert wurde verlängerte Stimulationszeiten32. Im Gegensatz dazu nutzt die DART-Technologie intrazelluläre ROS-Sensoren, die in Alginat eingekapselte Zellen für eine direkte batteriebetriebene Niederspannungs-Gleichstromstimulation innerhalb von Sekunden über zwei einfache Akupunkturnadeln sensibilisieren, ohne dass Elektronik verwendet oder implantiert werden muss. Tatsächlich ist die Elektrostimulation durch Akupunkturnadeln bereits Standardpraxis in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Entzündungen, chronischen Schmerzen, Muskelkrämpfen und neurologischen Störungen50,51 und stellt eine von der WHO49 zugelassene und weltweit praktizierte Therapiemethode dar. Da das DART-System bei höheren Spannungen keine Stunden benötigt, bei niedrigeren Spannungen jedoch nur Sekunden, um die Transgenexpression auszulösen, weist es eine höhere Energieeffizienz und Sicherheit auf. Daher glauben wir, dass die schnelle, elektronikfreie, direkte, batteriebetriebene Niederspannungs-Gleichstromsteuerung therapeutischer Transgene in menschlichen Zellen einen Fortschritt darstellt und das fehlende Glied darstellt, das es Wearables ermöglichen wird, in nicht allzu ferner Zukunft Gene zu steuern.

Auf der molekularen Seite der elektrogenetischen Schnittstelle nutzt DART die allgegenwärtige KEAP1/NRF2-vermittelte Erkennung von ROS. Die ROS-Produktion ist Teil des zellulären Atmungsprozesses34,52, wir haben jedoch festgestellt, dass die intrinsischen Mengen der ROS-Produktion und das KEAP1/NRF2-vermittelte ROS-Managementsystem DART nicht beeinträchtigen und DART-spezifische Promotoren nicht wesentlich induzieren. Stattdessen müssen menschliche Zellen durch ektopische Expression von nativem KEAP1 und NRF2 für die elektroinduzierbare ROS-Produktion sensibilisiert werden, wodurch die ROS-Erkennung auf synthetische PDART-Promotoren umgeleitet wird, die die biopharmazeutische Produktion vorantreiben. Wie bei anderen synthetischen Transkriptionskontrollmodalitäten kann die Aktivierung endogener Gene nicht vollständig ausgeschlossen werden7; Eine vergleichende Deep-Sequencing-Analyse ergab jedoch, dass ein solcher Effekt minimal ist. Auch die massenspektroskopische Analyse des Kulturmediums zeigte keinen wesentlichen Unterschied zwischen nicht-stimulierten und elektrostimulierten Zellkulturen, was darauf hindeutet, dass die DART-Aktivierung nicht zu einer ausreichenden Elektrolyse im Kulturmedium führt, um die Zellsysteme zu stören. Darüber hinaus besteht DART ausschließlich aus endogenen Komponenten und umfasst die einfache ektopische Expression der nativen endogenen Faktoren KEAP1 und NRF1 sowie Zielpromotoren, die durch Fusion nativer Tandem-ARE-Elemente zu einer minimalen Promotorbox zusammengesetzt werden, was die Risiken minimieren sollte, die mit der Zelltechnik verbunden sein können, wie z als neoplastische Transformation.

Qualitativ gesehen wird die elektrostimulierte ROS-Produktion durch die Entstehung potenziell gefährlicher Chlorionen und Chlorgas sowie Protonen und Wasserstoffgas an der Anode bzw. Kathode ausgelöst; Wir fanden jedoch heraus, dass die Elektrostimulation weder auf die Lebensfähigkeit noch auf das Transkriptom der Zellen noch auf die Zusammensetzung des Mediums negative Auswirkungen hatte, was vermutlich auf die niedrige Spannung und die kurzen Induktionszeiten von nur wenigen Sekunden zurückzuführen ist. Tatsächlich löste eine einzige tägliche Elektrostimulation implantierter gentechnisch veränderter Zellen bei 4,5 V für 10 Sekunden die Produktion und Freisetzung von ausreichend Insulin aus, um die Normoglykämie bei experimentellem Typ-1-Diabetes wiederherzustellen, und zeigte eine vergleichbare Wirksamkeit wie langwirksame Insulintherapien, die den Blutzuckerspiegel 24 Jahre lang einigermaßen stabil halten können h18,22,32. Die DART-Kontrolle lieferte auch ausreichend Insulin, um die postprandiale glykämische Abweichung schnell abzuschwächen, wie durch GTTs gezeigt. Darüber hinaus war die DART-Steuerung reversibel und durch Variation der Spannung und/oder der Elektroinduktionsperiode auch fein abstimmbar. Insbesondere haben wir auch mehrere Biomarker für Insulinmangel bei Tieren untersucht, die mit dem DART-System unter Verwendung unterschiedlicher Batterien, unterschiedlicher Induktionsperioden und unterschiedlicher Frequenzen behandelt wurden. Die Verbesserungen des Glukose- und Insulinspiegels bestätigen, dass DART ein effizientes System ist. Darüber hinaus würde die Verbesserung des Ketonspiegels bei diabetischen Mäusen auch das Risiko einer diabetischen Ketoazidose verringern.

Während wir uns für die Proof-of-Concept-Validierung für die DART-kontrollierte Insulinproduktion entschieden haben, sollte es einfach sein, die DART-Steuerung mit der In-situ-Produktion und -Dosierung einer breiten Palette von Biopharmazeutika zu verknüpfen. Wir glauben, dass einfache elektrogenetische Schnittstellen wie DART, die analoge biologische Systeme funktionell mit digitalen elektronischen Geräten verbinden, vielversprechend für eine Vielzahl künftiger gen- und zellbasierter Therapien sind, darunter genetische Interventionen mit geschlossenem Regelkreis, Echtzeitdosierung und globale telemetrische Überwachung medizinisches Personal oder Algorithmen.

Konstruktionsdetails für alle Vektoren finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Zu den Schlüsselplasmiden gehörten (1) ein konstitutiver KEAP1-Expressionsvektor (pJH1004, PhCMV-KEAP1-pA) und der entsprechende Vektor, der invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) der Sleeping Beauty (SB)-Transposase enthielt (pJH1054, ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR) für die Erzeugung stabiler Zelllinien; (2) ein konstitutiver NRF2-Expressionsvektor (pJH1003, PhCMV-NRF2-pA und pJH1101, ITR-PhCMV-NRF2-pA: PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR); und (3) NRF2-abhängige synthetische Promotoren, die ARE-Operatorstellen enthalten, die mit einem Minimalpromotor fusioniert sind (pJH1005, PDART-SEAP-pA und pJH1169, ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS:PmPGK-ZeoR-pA-ITR).

Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293, ATCC, CRL-11268), menschliche Fibrosarkomzellen (HT-1080, ATCC, CCL-121), menschliche zervikale Adenokarzinomzellen (HeLa, ATCC, CCL-2), menschliche Telomerase-immortalisierte mesenchymale Stammzellen (hMSC-TERT53, RRID:CVCL_Z015), menschliche Leberkrebszelllinie (Hep G2, ATCC, CRL-11997), menschliche kolorektale Adenokarzinomzelllinie (Caco-2, ATCC, HTB-37), Maus-Myoblastenzelllinie (C2C12, ATCC, CRL-1772), Babyhamster-Nierenzellen (BHK-21, ATCC, CCL-10) und Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO-K1, ATCC, CCL-61) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Kat.-Nr. 52100-39, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 100 mM Prolin (nur CHO-K1), 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Kat.-Nr. F7524, Chargen-Nr. 022M3395, Sigma-Aldrich) und 1 % (v /v) Streptomycin/Penicillin (Kat.-Nr. L0022, Biowest) und wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gezüchtet. Zur Transfektion wurden 50.000 Zellen (CellDrop BF Brightfield Cell Counter, DeNovix) pro Well auf einer 24-Well-Platte (Kat.-Nr. 3524, Corning Life Sciences) ausgesät, 12 Stunden lang kultiviert und durch Zugabe von 50 µl einer Mischung transfiziert enthält 1,6 µg Polyethylenimin (PEI MAX, MW 40.000, 1 µg µl−1 in ddH2O, Kat.-Nr. 24765-2, Polysciences) und 0,5 µg Plasmid-DNA (äquimolare Konzentrationen für Plasmidmischungen). Nach 8 Stunden wurde die Mischung durch Standardkultivierungsmedium (700 µl) ersetzt.

Insgesamt 1,5 × 105 HEK293- oder hMSC-TERT-Zellen wurden mit pJH1101 (200 ng), pJH1054 (550 ng), pJH1169 (400 ng) und pJH42 (PhCMV-SB100X-pA) co-transfiziert, was für die konstitutive Expression eines hyperaktiven SB kodiert Transposase54 (200 ng). Nach der klonalen Expansion wurden die monoklonalen Zelllinien durch Elektrostimulation gescreent und die beste Zelllinie DCINS für In-vitro- und Tierstudien ausgewählt.

Die 2,5 × 106 HEK293-Zellen wurden vor der Transfektion mit 30 μg pJH3 (PhCMV-SEAP-pA) 24 Stunden lang in eine Schale mit 10 cm Durchmesser (Greiner Bio-one, Kat.-Nr. 664160) ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen resuspendiert und gleichmäßig in zwei Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Die Behandlungsgruppen wurden über unterschiedliche Zeiträume mit 5 V Gleichstrom stimuliert. Proben wurden zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten 48 Stunden lang gesammelt, um die Anzahl lebensfähiger Zellen und die SEAP-Produktion zu quantifizieren.

ROS-modulierende Verbindungen wurden 30 Minuten vor der Durchführung der Elektrostimulation sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Experimente in den in den Legenden der Abbildungen angegebenen Konzentrationen bereitgestellt. Alle verwendeten Verbindungen stammten von Sigma-Aldrich, nämlich NAC40 (Kat.-Nr. A7250-50G), GKT136901 (Kat.-Nr. 5340320001), AEBSF (Kat.-Nr. SBR00015-1ML), ML171 (Kat.-Nr. 492002-10MG). ) und VAS2870 (Kat.-Nr. SML0273-25MG)41.

Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Resazurin (50 μg ml-1, Kat.-Nr. R7017, Sigma-Aldrich) inkubiert, bevor die Fluoreszenz bei 540/590 nm aufgezeichnet wurde (Plattenlesegerät Tecan Infinite 200 PRO, Tecan Group AG)32.

Die SEAP-Spiegel wurden in Zellkulturüberständen mithilfe eines kolorimetrischen Assays ermittelt. Insgesamt 100 µl 2× SEAP-Assaypuffer (20 mM Homoarginin, 1 mM MgCl2 und 21 % Diethanolamin, pH 9,8) wurden mit 80 µl hitzeinaktiviertem (30 Min. bei 65 °C) Kulturüberstand gemischt. Nach der Zugabe von 20 µl Substrat (120 mM p-Nitrophenylphosphat; Kat.-Nr. AC128860100, Thermo Fisher Scientific) wurde die Absorption 30 Minuten lang bei 405 nm und 37 °C (Tecan Infinite 200 PRO) aufgezeichnet und die SEAP-Werte bestimmt bestimmt wie zuvor beschrieben55.

Elektrostimulierte oder chemisch induzierte Zellen wurden mit 300 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Kat.-Nr. 14190-094, Thermo Fisher Scientific) gewaschen und 45 Minuten lang in 500 µl FBS-freiem DMEM mit 25 µmol l−1 2′ inkubiert. 7′-Dichlorfluoresceindiacetat (Kat.-Nr. D6883, Sigma-Aldrich) wurde erneut mit 300 µl PBS gewaschen und anschließend wurden die ROS-Werte durch Fluoreszenzassay56 (485/535 nm, Tecan Infinite 200 PRO) quantifiziert.

Insulin wurde mit einem ELISA-Kit (Kat.-Nr. 10-1247-01, Mercordia) quantifiziert.

Der Blutzucker wurde mit den klinisch zugelassenen ContourNext-Teststreifen und dem ContourNext ONE-Lesegerät (Ascensia Diabetes Care)57 quantifiziert.

Die Kulturüberstände von DART-transgenen Zellen, die 30 s lang bei 10 V Gleichstrom elektrostimuliert wurden, wurden direkt durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie analysiert, wobei nicht stimulierte isogene Zellkulturen als Negativkontrollen verwendet wurden. Die Proben wurden direkt mit 0,3 ml min−1 mit einem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiegerät (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific) injiziert und die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometriespektren wurden im positiven und negativen Ionenpolaritätsmodus unter Verwendung eines maXis 4 G-Hochleistungsgeräts aufgezeichnet. Auflösungsmassenspektrometer (Bruker), ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle, eingestellt auf 200 °C Kapillartemperatur und 4,5 kV Sprühspannung.

Die Konzentrationen von Maus-Interferon (IFN)-γ, Interleukin (IL)-6 und Tumornekrosefaktor (TNF)-α wurden mithilfe von IFN-γ (Kat.-Nr. BMS606-2) und IL-6 (Kat.-Nr. BMS603HS) quantifiziert. bzw. TNF-α (Kat.-Nr. BMS607HS) Maus-ELISA-Kits (alle von Thermo Fisher).

Das im Kulturmedium gelöste Chlorgas wurde mithilfe von Teststreifen (DPD-1, Kat.-Nr. 486637) analysiert, die mit einem Photometer (eXact EZ Photometer, Kat.-Nr. 486205) (alle von ITS Europe) quantifiziert wurden.

Der mittlere pH-Wert wurde mit hochpräzisem pH-Testpapier (Kat.-Nr. D-52348, MACHEREY-NAGEL) gemessen und der Blut-pH-Wert wurde mit einem Photometer (eXact EZ Photometer, Kat.-Nr. 486205, ITS Europe) mit pH-Streifen gemessen ( Kat.-Nr. 486639, ITS Europe).

Exponentiell wachsende Zellen wurden in eiskaltem RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl 8,0, 1 % Nodidet P-40 (NP40), 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM NaF) lysiert und Proteaseinhibitoren; Roche), während 30 Minuten bei 4 °C unter kontinuierlichem Rühren, gefolgt von Schleudern bei 15.000 g für 20 Minuten bei 4 °C. Die Überstände wurden auf Eis in frische Röhrchen überführt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem Pierce BCA Protein Assay Kit (Kat.-Nr. 23225, Thermo Fisher) quantifiziert. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten lang in 2× Laemmli-Puffer bei 95 °C gekocht. Anschließend wurden 20 μg Probe durch SDS-PAGE aufgelöst und in Transferpuffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 20 % Methanol) auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (Kat.-Nr. 88518, Thermo Fisher) übertragen. Nach dem Transfer wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch blockiert und mit KEAP1 (Kat.-Nr. ab227828, Abcam; Verdünnung 1:5.000) und NRF2 (Kat.-Nr. ab137550, Abcam, Verdünnung 1:5.000) inkubiert ) Primärantikörper über Nacht bei 4 °C, gefolgt von Inkubation mit Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Linked-Whole-Antikörper, Kat.-Nr. GENA934-1ML, Sigma-Aldrich, 1:10.000 Verdünnung). Die Blots wurden nach Zugabe des Chemilumineszenzsubstrats (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Kat.-Nr. 32106, Thermo Fisher) mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem (FusionPulse TS, Kat.-Nr. 121172301, v.5.12a) sichtbar gemacht. Als Kontrolle wurden Maus-Anti-β-Actin (Sigma, Kat.-Nr. A2228, 1:5.000-Verdünnung) und Schaf-Anti-Maus-IgG (Sigma, Kat.-Nr. GENA931V, 1:10.000-Verdünnung) verwendet.

Die Messenger-RNA-Proben aus kultivierten Zellen wurden mit einem Quick-RNA Miniprep-Kit (Zymo Research, Kat.-Nr. R1054) extrahiert und mit einem NanoDrop 2000 (Thermo Fisher) quantifiziert. Die komplementäre DNA-Bibliothek wurde mit einem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Kat.-Nr. 4368814) erstellt. Die qPCR-Analyse mit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Kat.-Nr. 1725271) wurde von QuantStudio 3 (Thermo Fisher) durchgeführt. Die für KEAP1-, NRF2- und Housekeeping-Gene verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 8 aufgeführt.

Die Serum-HbA1c-Spiegel wurden mit einem Maus-HbA1c-Assay-Kit (Kat.-Nr. 80310, CrystalChemA) quantifiziert.

Die Serumspiegel wurden unter Verwendung der ELISA-Testkits Ketonkörper (Kat.-Nr. MAK134-1KT, Sigma-Aldrich), Triglycerid (ab65336, Abcam) und Glucagon (Kat.-Nr. 10-1271-01, Mercodia) quantifiziert.

HEK293-Zellen wurden über Nacht ausgesät, 10 oder 25 s lang bei 5 V Gleichstrom elektrostimuliert und 8 Stunden danach zur vollständigen RNA-Extraktion unter Verwendung eines Quick-RNA Miniprep-Kits (Zymo Research, Kat.-Nr. R1054) gesammelt. Die RNA-Qualität wurde mit einem BioAnalyzer (Agilent Technologies) untersucht. Die Bibliotheken wurden mit dem Illumina Truseq Stranded Total RNA Library PrepKit (Illumina) vorbereitet. Jede Bibliothek wurde mit einem HiSeq 2500-System (Illumina) sequenziert, was zu etwa 30 Millionen Single-End-81-mer-Reads nahe dem 3'-Ende der mRNA pro Probe führte.

Sequenzierungsdaten wurden demultiplext und hauptsächlich mithilfe eines Snakemake-Workflows58 analysiert, der aus Trimmomatic (v.0.35), Ausrichtung auf das GRCh38-Genom mit HISAT2 (v.2.1.0) und SAMtools (v.1.9) zum Sortieren und Indizieren der Alignment-BAM-Dateien bestand und featureCounts aus dem Subread-Paket (v.2.0.1), um Reads in den Genbereichen zu zählen, unter Verwendung der menschlichen Ensembl-Annotation v.105. Die Zählvektoren für alle Proben wurden in einer Tabelle zusammengefasst, die dann der Sekundäranalyse in R unterzogen wurde. Die Qualitätskontrolle und Probenkonsistenz wurden mit einer Hauptkomponentenanalyse mit dem R-Paket PCATools überprüft. Die Zähltabelle wurde in der sekundären (statistischen) Analyse mit R-Skripten unter Verwendung von EdgeR (v.3.32)59 verarbeitet, insbesondere einem binomialen verallgemeinerten logarithmisch-linearen Modell mit Kontrasttests. Das Ergebnis waren Listen von Genen, die hinsichtlich der differentiellen Expression anhand des P-Werts geordnet waren, und es wurde ein Benjamini-Hochberg-bereinigter P-Wert als Schätzung der Falscherkennungsrate verwendet.

Die Beschichtung mit Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-polystyrolsulfonat (PEDOT:PSS) wurde durch Anodenabscheidung60 unter Verwendung einer elektrochemischen Workstation (CHI760E, Seriennummer E1174, Version 20.4.0.0) durchgeführt. Der Prozess wurde in 40 ml wässriger Lösung (0,1 M KCl und 5 ml PEDOT:PSS-Lösung (1 % w/w in Dimethylsulfoxid)) bei 3,0 V Gleichstrom durchgeführt. Zur Elektroabscheidung wurde eine wässrige Lösung mit 5 mM H2PtCl6, 1 mM Harnstoff und 0,1 M H2SO4 verwendet. Als Gegen- bzw. Arbeitselektroden wurden Pt-Draht und mit PEDOT:PSS beschichtete Akupunkturnadeln (PEDOT:PSS/SS) verwendet. Die Gleichstromelektroabscheidung wurde mit einem Potentiostat (CHI760E) durchgeführt, der 10 Minuten lang auf eine optimierte Stromdichte von −20 mA cm−2 eingestellt war61. Nach der Elektroabscheidung wurden die Pt-PEDOT:PSS/SS-Elektroden mit Millipore-Wasser gewaschen und 6 Stunden lang bei 90 °C getrocknet. Die Morphologie der Sonden wurde unter einem Rasterelektronenmikroskop (FEI Sirion 400 NC) bei einer Beschleunigungsspannung von 5,0 kV beobachtet. Zur Aufzeichnung des elektrochemischen Stroms wurde ein elektrochemischer Analysator CHI760E verwendet, der von der CHI-Software gesteuert wurde.

Drei Tandem-AA-Batterien (IEC-Name LR06; Energizer, Kat.-Nr. E300173103) wurden an einen Batterietester mit Potentiostat (CHI760E) angeschlossen. Die galvanostatische Entladung wurde mit der Chronopotentiometrie-Methode mit dem angegebenen Anodenstrom gemessen.

Die Datenpräsentation, die Stichprobengröße der biologischen Replikate (n), die statistische Analyse und die Signifikanz der Unterschiede sind in den Abbildungen dargestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle In-vitro-Experimente mindestens zweimal wiederholt. Für die Mausexperimente wurden biologische Replikate (n = 5 Mäuse) verwendet, sofern nicht anders angegeben. Die Einzelheiten sind in der jeweiligen Figurenlegende beschrieben. Um die statistische Signifikanz von Unterschieden bei mehreren Vergleichen zu bestimmen, verwendeten wir GraphPad Prism 8 (v.9.2.0, GraphPad Software) oder Microsoft Excel (v.16.51, Microsoft) und einen zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Test und einseitige Varianzanalyse.

Zusatzvideo 1 wurde in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 mit einem Huawei P30-Mobiltelefon gefilmt. Die Zusatzvideos 2 und 3 wurden mit einem Mikroskopsystem Zeiss LSM 980 Airyscan aufgenommen. Die Filme wurden mit der Software Shotcut (v.21.09.20) und HandBrake (v.1.4.2) weiterverarbeitet.

Für die In-vitro-Elektrostimulation haben wir elektrosensitive Zellen in Standard-24-Well-Platten mit 700 µl Kulturmedium kultiviert, die das Eintauchen von zwei Platinelektroden mit 6 mm Abstand ermöglichen, die auf einem maßgeschneiderten Deckel befestigt sind. Der Deckel einer 24-Well-Platte (Kat.-Nr. 3524, Corning Life Sciences) wurde mit Steckbrettern (Kat.-Nr. H25PR500, Reichelt Elektronik) und Platindrähten (Kat.-Nr. HXA 050, Cooksongold; ergänzende Abbildung 1a) beklebt ,B). Die Stromversorgung erfolgte mit den angegebenen Parametern und Zeiträumen über ein Gleichstromnetzteil (KD3005P, KORAD) oder verschiedene Akkupacks. Rechteckige Wechselstromimpulse wurden von einem HP3245A Universal Source-Funktionsgenerator (Kat.-Nr. 3245A, Hewlett Packard) erzeugt, der an einen Linearverstärker P200 (Kat.-Nr. P200, FLC Electronics) angeschlossen war. Die verwendeten AC-Parameter sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die Gleich- und Wechselspannungen und -ströme wurden durch Anschluss eines CHI760E-Potentiostaten und eines digitalen Oszilloskops (Kat.-Nr. DS1052E, Soochow) bestätigt. Für die In-vivo-Elektrostimulation subkutan implantierter mikroverkapselter Zellen verwendeten wir drei AA-Batterien (IEC-Name LR06; Energizer, Kat.-Nr. E300173103) als Gleichstromquelle und sterile Akupunkturnadeln mit platinierter Spitze oder maßgeschneiderte Platinelektroden (Kat.-Nr. 1503030). , Wandrey) mit 6 mm Abstand als Elektroden. Anschließend wurde vor der Elektroinduktion 1 ml frisches DMEM-Medium an der Implantationsstelle injiziert.

Neben AA-Batterien haben wir auch AAA-Batterien (IEC-LR03, Energizer, Kat.-Nr. E303271700), 9-V-Blöcke (IEC-6LR61, Conrad, Kat.-Nr. CE-650900) und Knopfzellen (IEC-CR2032) verwendet , Energizer, Kat.-Nr. E303272400), 12 V 23 A Alkalibatterien (IEC-8LR23, Energizer, Kat.-Nr. E301536201), A220/504 A Exell-Batterien (Kat.-Nr. 4331974451, Exell), eine Powerbank von Belkin (Kat.-Nr. 13350487) und USB-C-Handyladegeräte von Apple und Huawei für In-vitro- oder In-vivo-Experimente.

Die Elektroden wurden durch zyklische Voltammetrie charakterisiert. Die Kalibrierung wurde in 10 mM Kaliumhexacyanoferrat (III) (K3Fe(CN)6)-Lösung durchgeführt. Das Experiment wurde mit einem Potentiostat CHI760E unter Verwendung von zwei Platinelektroden als Arbeits- und Gegenelektroden und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode (CHI111P, IJ Cambria Scientific) durchgeführt. Zur Kalibrierung der Elektrode wurden zyklische Voltammogramme zwischen –0,3 und 0,6 V und zur Messung bei –5 bis 5 V bei einer Abtastrate von 10 mV s−1 durchgeführt. Das Drei-Elektroden-System wurde zur ROS-Erzeugung und SEAP-Induktion mit transienten DART-technischen Zellen verwendet.

Um menschliche DCINS-Zellen vor dem Immunsystem der Maus zu schützen und gleichzeitig die freie Diffusion von Nährstoffen und therapeutischen Proteinen zu ermöglichen, verwendeten wir eine in klinischen Studien validierte, von der US-amerikanischen FDA lizenzierte Verkapselungstechnologie auf Alginatbasis48. DCINS wurden durch Mischen von 1,0 × 108 DCINS mit 20 ml Alginat (Gew./Vol., 1,8 %; Na-Alginat, Kat.-Nr. 11061528, Buechi) in kohärente Alginat-Poly(l-lysin)-Alginat-Mikrokapseln mit einem Durchmesser von 400 µm mikroverkapselt Labortechnik), 200 ml Poly(l-lysin) 2000 (w/v, 0,05 %; Kat.-Nr. 25988-63-0, Alamanda Polymers) Lösung und unter Verwendung eines Einkapselers (Inotech Encapsulator IE-50R, EncapBiosystems) auf eingestellt Folgende Parameter: 200-μm-Düse mit einer Vibrationsfrequenz von 1.025 Hz, eine 20-ml-Spritze mit einer Durchflussrate von 400 Einheiten und 1,12 kV Spannung für die Perlendispersion. Dann wurden 1,5 ml serumfreies DMEM mit 7,5 × 106 mikroverkapselten Zellen (500 Zellen pro Kapsel) durch eine 3-ml-Spritze (Kat.-Nr. 9400038, Becton Dickinson), die mit einer 0,7 × 30-mm-Nadel (Kat.-Nr. 9400038, Becton Dickinson) ausgestattet war, subkutan implantiert . Nr. 30382903009009, Becton Dickinson).

T1D-Mäuse wurden etabliert, indem 6 Wochen alte männliche Wildtyp-Swiss-Mäuse (C57BL/6J, Janvier Labs) 8 Stunden pro Tag an vier aufeinanderfolgenden Tagen fasten ließen und ihnen gleichzeitig eine Einzeldosis frisch verdünntes Streptozotocin (Kat.-Nr. S0130, Sigma-Aldrich; 80 mg kg−1 in 300 μl Natriumcitratpuffer (pH 4,3)). Eine T1D-assoziierte anhaltende Nüchternhyperglykämie wurde nach 6 Tagen durch ein 8-stündiges Nüchternglykämieprofil bestätigt. Für GTTs wurden behandelten Tieren 1,5 g/kg Glucose intraperitoneal injiziert und der Blutzuckerspiegel wurde in regelmäßigen Abständen aufgezeichnet. Das Blutinsulin wurde mithilfe von Microtainer-Serumtrennröhrchen (Kat.-Nr. 365967, Becton Dickinson) quantifiziert. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Schweizer Tierschutzgesetzgebung durchgeführt, vom Veterinäramt des Kantons Basel-Stadt, Schweiz (Lizenznr. 2996/30779) genehmigt und von S. Xue (LTK4899) und J. Huang durchgeführt ( LTK5912) am Departement Biosystemwissenschaften und -technik der ETH Zürich in Basel und gemäß den Richtlinien des Europäischen Gemeinschaftsrates (2010/63/EU), genehmigt von der Französischen Republik (Projekt-Nr. DR2018-40v5 und APAFIS-Nr. 16753) und durchgeführt von S. Xue, J. Huang und G. Charpin-El Hamnri (Nr. 69266309) an der Universität Lyon, Institut Universitaire de Technologie. Alle Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten (fünf Mäuse pro Käfig). Die Umgebungstemperatur betrug 21 ± 1 °C bei 50 ± 10 % Luftfeuchtigkeit.

Elektrisch leitfähige, doppelt klebende Pflaster (Kat.-Nr. 9701-50, 3M Science) wurden mit Drähten als Elektroden versehen, die zur Durchführung der Elektrostimulation an der Implantationsstelle befestigt wurden.

Die erste Elektrostimulation wurde 4 Stunden nach der Injektion der mikroverkapselten Zellen durchgeführt. Zur regelmäßigen Glukoseüberwachung über mehrere Wochen hinweg wurden die Mäuse um Mitternacht 10 Sekunden lang mit 4,5 V Gleichstrom elektrostimuliert und anschließend 6–8 Stunden lang zur Messung des Blutzuckerspiegels oder zur Blutentnahme gefastet. Zur Glukoseüberwachung über einen ganzen Tag hinweg zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden die Mäuse um 6:00 Uhr elektrostimuliert. Für das Mausexperiment mit mehreren Elektrostimulationen pro Tag wurde die erste um Mitternacht durchgeführt, gefolgt von weiteren Stimulationen im Abstand von 6 Stunden.

Mit einer 200-µl-Mikrohämatokrit-Glaskapillare (Avantor VWR, Kat.-Nr. 521-9100) wurden Blutproben aus den Schwanz- oder Stammvenen entnommen, in Blutsammelröhrchen (BD Microtainer, Kat.-Nr. BDAM365968) überführt und zentrifugiert bei 8.000g für 2 Min. Das überstehende Serum wurde innerhalb einer Stunde nach der Blutentnahme analysiert oder bei –80 ° C eingefroren.

8 Wochen alten männlichen Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen wurden eingekapselte gentechnisch veränderte Zellen injiziert. Alle stimulierten und nicht stimulierten Mäuse, die zwei Elektroden enthielten, wurden nach 30 Minuten oder 48 Stunden Elektrostimulation mit 4,5 V Gleichstrom für 10 Sekunden getötet und in 10% Formalinlösung (Kat.-Nr. HT501128-4L, Sigma-Aldrich) gelagert.

Akupunkturnadeln wurden entfernt und das umgebende Gewebe explantiert und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert (100 ml 40 % Formalin, 900 ml ddH2O, 4 g l−1 NaH2PO4 und 6,5 g l−1 Na2HPO4, pH 7). Die Gewebeproben wurden zugeschnitten, in zunehmenden Ethanolkonzentrationen dehydriert, mit Xylol geklärt, infiltriert und in Paraffinwachs eingebettet, mit einem EXAKT 300 CP-System (EXAKT Technologies) in 2–4 µm Dicke geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Gewebeschnitte wurden lichtmikroskopisch analysiert und Bilder mit einer Olympus UC30-Kamera aufgenommen. Das Gewebe um den Fußabdruck der Akupunkturnadel herum wurde von einem Pathologen bei AnaPath Services gemäß der Norm ISO 10993-6:2016(E) histopathologisch untersucht. Darüber hinaus wurde die Kollagendenaturierung bewertet, um mögliche thermoelektrische Auswirkungen auf das Gewebe nach der Elektrostimulation auszuschließen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit und den ergänzenden Materialien verfügbar sind. Alle in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Originalplasmide sind auf Anfrage erhältlich. Die Sequenzen pJH1003 (GenBank-Zugangsnr. ON256650), pJH1004 (GenBank-Zugangsnr. ON256651), pJH1005 (GenBank-Zugangsnr. ON256652), pJH1054 (GenBank-Zugangsnr. ON256653), pJH1101 (GenBank-Zugangsnr. ON256654) und pJH1169 ( GenBank Zugangsnummer ON256655) sind auf GenBank verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der in diesem Dokument verwendete Code ist auf GitHub (https://github.com/Jinbo2022) öffentlich verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken H. Zhao, M. Mansouri, S.-S. Cao und PG Ray für allgemeine Ratschläge, E. Loertscher und A. Wokaun für Ratschläge zur Elektrochemie und H. Zulewski für Ratschläge zur Diabetologie. Wir danken außerdem S. Mittelheisser und M. Pfeffer für die Unterstützung bei der Massenspektrometrie, C. Beisel, I. Nissen-Naidanow und E. Vogel-Bucklen für die Unterstützung bei der RNA-Sequenzierung, M. Okoniewski für die Unterstützung bei der RNA-Seq-Analyse, R . Vetter und H.-M. Kaltenbach für die Unterstützung bei der statistischen Analyse, M. Viviani für die Unterstützung bei der Fluoreszenzmikroskopie, G. Charpin-El Hamri für die Unterstützung bei Tierversuchen, H. Li für die Unterstützung bei der Elektrochemie und D. Maity für die Unterstützung bei Elektroden, Elektrochemie und Batterietests. Diese Arbeit wurde durch ein Advanced Grant des European Research Council (ElectroGene; Grant-Nr. 785800) und teilweise durch den Schweizerischen Nationalfonds NCCR Molecular Systems Engineering unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die Eidgenössische Technische Hochschule Zürich

Departement für Biosystemwissenschaften und -technik, ETH Zürich, Basel, Schweiz

Jinbo Huang, Shuai Xue, Peter Buchmann, Ana Palma Teixeira & Martin Fussenegger

Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Basel, Basel, Schweiz

Martin Fussenegger

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JH, SX und MF haben das Projekt entworfen. JH führte die Zellkulturexperimente durch. JH, SX, PB und APT haben die elektrischen Geräte entworfen. JH und SX führten elektrochemische und Tierversuche durch. JH, SX, APT und MF haben die Experimente entworfen und die Ergebnisse analysiert. JH, SX, APT und MF haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Martin Fussenegger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Metabolism dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin für Handhabung: Isabella Samuelson, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Zeitverlaufsanalyse intrazellulärer ROS in DART-technisch hergestellten HEK-293-Zellen nach Elektrostimulation mit 5 Volt Gleichstrom für 20 s. Die ROS-Werte wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. MFI: mittlere Fluoreszenzintensität. b,c Wirkung von ROS-Inhibitoren auf mit DART hergestellte HEK-293-Zellen. SEAP-Produktion (b) und Zelllebensfähigkeit (c) 24 Stunden nach Elektrostimulation mit 5 Volt Gleichstrom für 20 s. Die Zellen wurden mit dem ROS-Fänger N-Acetyl-L-Cystein (NAC, 2 mM) oder den Inhibitoren der ROS-erzeugenden Enzyme GKT136901 (0,2 μM), AEBSF (2 μM), ML171 (1 μM) und VAS2870 (2) inkubiert μM) für 30 Minuten vor der Durchführung der Elektrostimulation. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± Standardabweichung der vier angegebenen Datenpunkte dar. Die P-Werte wurden zwischen der stimulierten und der nicht stimulierten bzw. angezeigten Gruppe berechnet.

Quelldaten

al, ROS-Erzeugung, SEAP-Produktion und Zelllebensfähigkeit wurden nach Behandlung der Zellen mit H2O2 (ac), Oltipraz (df), Diquatdibromid (gi) oder Aspirin (jl) in den angegebenen Konzentrationen analysiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Inkubation mit 50 μg/ml Resazurin für 2 Stunden bei 37 °C gemessen. Die in allen Feldern als DC (orangefarbene Balken) markierten Proben stellen die Positivkontrolle dar (Stimulation bei 5 Volt DC für 20 s). Die Spalten stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung der vier angegebenen Datenpunkte dar. Die Symbole in (c), (f), (i) und (l) stellen den Mittelwert ± SD von 4 Bestimmungen dar. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. P-Werte wurden zwischen der stimulierten und der nicht stimulierten Gruppe berechnet.

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a, Schematisches Modell des Drei-Elektroden-Aufbaus, mit einem Potentiostat, verbunden mit einer Ag/AgCl-Referenzelektrode und zwei Platinelektroden, von denen eine als Arbeitselektrode und die andere als Gegenelektrode dient. b,c, Cyclovoltammogramm (CV) in Standardlösung von Kaliumhexacyanoferrat (III) (K3Fe(CN)6) (10 mM, schwarz) oder in Kulturmedium (DMEM plus 10 % FBS, rot) im Potentialfenster von −0,3 bis 0,6 V (b) und –5,0 bis 5,0 V (c). Alle Lebensläufe wurden mit einer Rate von 10 mV s−1 gescannt. df, ROS-Quantifizierung in zellfreiem Kulturmedium (d), DART-entwickelte HEK-293-Zellkulturen (e) und DART-entwickelte hMSC-TERT-Zellkulturen (f). RFU, relative Fluoreszenzeinheiten. g, h, SEAP, produziert von DART-technisch hergestellten HEK-293-Zellen (g) und DART-technisch hergestellten hMSC-TERT-Zellen (h), 24 Stunden nach der Elektrostimulation. i,j, Lebensfähigkeit von DART-manipulierten HEK-293-Zellen (i) und DART-manipulierten hMSC-TERT-Zellen (j), 24 Stunden nach der Elektrostimulation. Alle Stimulationen wurden mit dem Drei-Elektroden-System für 10 oder 20 Sekunden bei den angegebenen Spannungen durchgeführt. Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD dar; n = 4.

Quelldaten

a, Venn-Diagramm der Genexpressionsunterschiede zwischen nicht stimulierten Zellen (NS) und elektrostimulierten Zellen bei 5 Volt Gleichstrom für 10 s (TA) oder 25 s (TB). Die Gesamtzahl der sequenzierten Transkripte betrug 61487. b, Genexpressionsniveaus in TA im Vergleich zu NS. Die differentiell exprimierten Transkripte werden in Orange dargestellt. c, Genexpressionsniveaus bei TB im Vergleich zu NS. Die differentiell exprimierten Transkripte sind grün dargestellt. d, Genexpressionsniveaus bei TA im Vergleich zu TB. e, Heatmap der 500 wichtigsten Transkripte mit der größten Standardabweichung der Expressionszahlen zwischen nicht stimulierten Zellen (NS) und elektrostimulierten Zellen bei 5 Volt Gleichstrom für 10 s (TA) oder 25 s (TB). Jede Gruppe enthält drei Replikate. N1, N2 und N3 sind die Proben in der NS-Gruppe. T1, T2 und T3 sind die Proben in der TA-Gruppe. T4, T5 und T6 sind die Proben in der TB-Gruppe. Die 500 besten Transkripte werden in der Ergänzungsliste geordnet vom höchsten zum niedrigsten aufgeführt. Die Heapmap-Daten wurden von PCAtools in R. f, Heatmap der interessierenden Gene (450 Gene) analysiert. T1, T2 und T3 sind stark geclustert mit N1, N2 bzw. N3. Die Gengruppen werden durch Farben gekennzeichnet. Heatmap-Anmerkungen sind die gleichen wie in (e). Die Details der Clusterbildung jedes Gens sind in der Ergänzungsliste von oben nach unten aufgeführt. Die differentiell exprimierten Transkripte sind rot dargestellt. Mittlere Ausdrucksniveaus (n = 3) werden als natürliche Logarithmen in (b), (c) und (d) dargestellt. In (e) und (f) gibt die Farbe in der Heatmap die Ausdrucksebenen an. Die Daten stellen Log(e) der den Genen zugeordneten Sequenzierungsablesungen dar.

Wechselstrom: Es wurden eine (a), zwei (b) und drei (c) Duracell- oder Energizer-Alkali-AAA-Batterien verwendet, die jeweils etwa 1,5 Volt lieferten. d, Eine Duracell- oder Energizer-Lithium-Knopfzelle CR2032 liefert etwa 3 Volt. ef, vier Duracell- oder Energizer-Alkalibatterien vom Typ AA (e) und AAA (f) liefern etwa 6 Volt. g, Eine Powerbank von Belkin, deren universeller USB-A 2,4 A-Anschluss bis zu 5 Volt liefert. h, Ladegeräte für Mobiltelefone von Apple und Huawei. Das Ladegerät wurde direkt an das Stromnetz angeschlossen und die Kabel des Ladegeräts wurden für den Anschluss an die im Kulturmedium eingetauchten Elektroden abgeschnitten. i, eine Duracell- oder Energizer-Alkalibatterie mit 12 Volt und 23 Ampere. j, Zwei Duracell- oder Energizer-9-Volt-Block-Alkalibatterien. k, zwei Duracell- oder Energizer-12-Volt-23-A-Alkalibatterien. l, Zwei A220/504 A Exell-Batterien liefern etwa 30 Volt. Die SEAP-Spiegel in den Überständen des Kulturmediums wurden 24 Stunden nach der Elektrostimulation für die angegebene Zeit gemessen. Die Spalten stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung der vier angegebenen Datenpunkte dar. P-Werte wurden zwischen der stimulierten und der nicht stimulierten Gruppe berechnet.

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a, Design von DNA-Konstrukten, die für die monoklonalen Zelllinien verwendet werden. Das DART-System basiert auf der konstitutiven Expression von KEAP1 (ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR, pJH1054) und NRF2 (ITR-PhCMV-NRF2-pA:PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR). , pJH1101) und vier Tandem-ARE (DART4)-kontrollierte SEAP-Reporter, gefolgt von Mausinsulin (mINS) (ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS: PmPGK-ZeoR-pA-ITR, pJH1169). Alle Konstrukte werden von invertierten terminalen Wiederholungen (ITR) zur Erkennung der SB100X-basierten Sleep Beauty-Transposase flankiert. b,c, Screening der monoklonalen HEK-293- (b) und hMSC-TERT-Zelllinien (c). HEK-293- oder hMSC-TERT-Zellen wurden stabil mit pJH1101, pJH1054 und pJH1169 transfiziert. Dreißig monoklonale Zelllinien wurden zufällig für die Profilierung der SEAP-Expression 24 Stunden nach der Elektrostimulation bei 4,5 Volt Gleichstrom für 20 Sekunden ausgewählt. In (c) zeigt das blaue Rechteck die beste monoklonale Zelllinie ihrer Klasse, DCINS, die für Folgeexperimente ausgewählt wurde. Die monoklonalen Zelllinien wurden in Medium, ergänzt mit Puromycin (2,5 μg/ml), Blasticidin (10 μg/ml) und Zeocin (100 μg/ml), kultiviert und selektiert. Die Daten in (b) und (c) sind Mittelwerte ± SD; n = 2; Die SEAP-Werte wurden durch Zellzahlen normalisiert. dg, Analyse der NRF2- und KEAP1-mRNA- und Proteinspiegel in Eltern- und DART-manipulierten Zellen. d,e, Relative mRNA-Spiegel von KEAP1 (d) und NRF2 (e) in Elternzellen (hMSC-TERT) und abgeleiteten DCINS-Zellen, analysiert durch quantitative Echtzeit-PCR. Die Spalten stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung der vier angegebenen Datenpunkte dar. f,g, Western-Blot-Analyse der Proteine ​​KEAP1 (f) und NRF2 (g) in Elternzellen (hMSC-TERT) und abgeleiteten DCINS-Zellen. Die gleiche Menge Zelllysat wurde auf das Gel aufgetragen und das Haushaltsprotein Aktin wurde als Beladungskontrolle verwendet. Die Experimente wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen in dg wiederholt. P-Werte wurden zwischen stimulierter und nicht stimulierter Gruppe oder angegebenen Gruppen berechnet.

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Die HbA1c-Spiegel im Blut von Wildtyp-Mäusen sowie nicht stimulierten und elektrostimulierten T1D-Mäusen wurden sechs aufeinanderfolgende Wochen lang wöchentlich nach der Implantation von Alginat-verkapselten DCINS-Zellen gemessen. b,c, Elektrostimulation von Mäusen mit elektrisch leitfähigen Klebeelektroden. b, Bild einer Maus mit leitfähigen Klebeelektroden, die im Abstand von 6 mm an der Implantationsstelle befestigt sind (schwarzer Kreis). c: Die Nüchternglykämie wurde vor der Implantation (Tag 0) und während vier Tagen nach der DCINS-Zellimplantation in drei Gruppen von T1D-Mäusen aufgezeichnet, nämlich Mäusen, die an der Implantationsstelle 10 Sekunden lang mit 4,5 Volt Gleichstrom stimuliert wurden, mit entweder klebrigen Flecken auf der Haut darüber die Implantationsstelle (Sticky-Patch stimuliert, grün) oder Platin-Akupunkturnadeln (stimuliert, rot) und „nicht stimulierte“ (blau) Mäuse. Als Kontrollen dienten auch Wildtyp-Mäuse (schwarz) und T1D-Mäuse ohne Implantate (Negativkontrolle, grau). Dieses Experiment wurde nicht wiederholt. d,e, Verabreichung von ROS-Fängern und ROS-erzeugenden Enzyminhibitoren an DART-implantierte T1D-Mäuse. Blutzuckerspiegel (d) und Insulinspiegel (e) bei nicht stimulierten und stimulierten Mäusen, denen subkutan ein ROS-Fänger (NAC, 600 mg/kg) oder Inhibitoren ROS-erzeugender Enzyme (GKT136901, 50 mg/kg; AEBSF, 0,6 mg/kg) an der Implantationsstelle, 30 min vor der Elektrostimulation (DC 4,5 Volt für 10 s). Vier Tage nach der Implantation wurden Blutproben zur Analyse entnommen. Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD dar; n = 5; Die Werte wurden auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert. Die statistische Analyse wurde durchgeführt zwischen: in (a) stimulierten und nicht stimulierten Gruppen (blau) und stimulierten und Wildtyp-Gruppen (schwarz); in (c): Sticky-Patch stimuliert und nicht stimuliert (grün), Sticky-Patch stimuliert und stimuliert (rot); in (d) und (e), stimulierte und nicht stimulierte Gruppe.

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ac-, IFN-γ (a)-, IL-6 (b)- und TNF-α (c)-Spiegel wurden im Serum von nicht stimulierten und stimulierten T1D-Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Implantation von Alginat-verkapselten DCINS-Zellen gemessen . d, Blut-pH-Analyse. Blutproben wurden von drei Gruppen (Wildtyp, nicht stimulierte T1D- und stimulierte T1D-Mäuse) 3 Minuten nach der Elektrostimulation mit 4,5 Volt Gleichstrom für 10 Sekunden entnommen. c, Der intraperitoneale Glukosetoleranztest (GTT) wurde nach 8-stündigem Fasten durch Verabreichung von 1,5 g/kg wässriger D-Glukose an Mäuse am Tag 3 nach der Implantation mikroverkapselter Zellen durchgeführt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Blutproben entnommen. Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD dar; in (a), (b), (c), (e), n = 5; in (d), n = 10; In (d) und (e) wurden die Werte auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert. In (a), (b), (c) wurde eine statistische Analyse zwischen stimulierten und nicht stimulierten Gruppen durchgeführt; in (d) wurde eine statistische Analyse zwischen der Wildtyp- und der T1D-Gruppe durchgeführt; In (e) wurde eine statistische Analyse zwischen stimulierten und nicht stimulierten Gruppen (blau) sowie stimulierten und Wildtyp-Gruppen (schwarz) durchgeführt.

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ad, Insulin (a), Keton (b), Triglycerid (c) und Glucagon (d) wurden im Serum von Wildtyp-, stimulierten T1D- und nicht stimulierten T1D-Mäusen am Tag 4 nach der Implantation von alginatverkapselten DCINS gemessen Zellen. Die stimulierten Tiere wurden drei Tage lang nacheinander 10 s lang bei 4,5 Volt Gleichstrom elektrostimuliert. Am 4. Tag wurde um 6 Uhr morgens eine Elektrostimulation durchgeführt und anschließend wurden die Tiere 6 Stunden lang fasten gelassen. Die Blutproben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Es gab zu keinem Zeitpunkt einen nennenswerten Unterschied zwischen der elektrostimulierten und der Wildtyp-Behandlungsgruppe. Um 6 Uhr morgens wurden unmittelbar nach der Elektrostimulation Blutproben entnommen und auf Blutinsulin und Biomarker für Insulinmangel untersucht. Die entsprechenden Profile der Blutzuckerspiegel sind in Abb. 5g dargestellt. Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD dar, n = 5; die Mäuse wurden einmal überwacht; Die Werte wurden auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert. P-Werte wurden zwischen stimulierten und nicht stimulierten Gruppen berechnet.

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af, die T1D-Mäuse wurden mit verschiedenen Spannungen für unterschiedliche Zeiträume elektrostimuliert. af-, Keton- (a,b), Triglycerid- (c,d) und Glucagon- (e,f)-Spiegel wurden im Serum von Wildtyp-, stimulierten und nicht-stimulierten T1D-Mäusen am Tag 4 nach der Implantation von Alginat-verkapselten DCINS gemessen Zellen. Die stimulierten Gruppen wurden drei Tage lang nacheinander mit den angegebenen Spannungen für die angegebenen Zeiträume elektrostimuliert. Zwei, drei, vier und fünf AA-Batterien lieferten jeweils 3,0, 4,5, 6,0 und 7,5 Volt Gleichstrom. Ein 9-V-Block lieferte 9,0 Volt Gleichstrom. Die Wildtyp-Proben stammten von zwei verschiedenen Gruppen von Mäusen ohne jegliche Behandlung. Die Blutproben wurden vor dem Fasten am 4. Tag entnommen. Die entsprechenden Profile der Blutspiegel von Glukose und Insulin sind in Abb. 6a-d dargestellt. gj, Profilierung von Biomarkern für Insulinmangel im Serum von Mäusen mit unterschiedlichen Induktionszeiten. g, Zeitplan der Elektrostimulation mit unterschiedlichen Frequenzen und der Fasten-Fütterungszyklus für alle Mäuse während des Experiments. hj-, Keton- (h), Triglycerid- (i) und Glucagon-(j)-Spiegel wurden im Serum von Wildtyp-, stimulierten T1D- und nicht-stimulierten T1D-Mäusen am Tag 4 nach der Implantation von Alginat-verkapselten DCINS-Zellen gemessen. Die stimulierten Gruppen wurden drei Tage lang nacheinander 10 Sekunden lang bei 4,5 Volt Gleichstrom mit den angegebenen Induktionsfrequenzen elektrostimuliert. Die Blutproben wurden am 4. Tag zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die entsprechenden Profile der Glukose- und Insulinspiegel im Blut sind in Abb. 6e bzw. f dargestellt. Die statistische Analyse wurde zwischen nicht stimulierten und stimulierten Gruppen oder angegebenen Gruppen durchgeführt. Die statistischen Bezeichnungen mit unterschiedlichen Farben in (h)–(j) beziehen sich auf die entsprechenden Datenpunkte mit derselben Farbe. Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD dar; n = 5; das Experiment wurde einmal durchgeführt; Die Werte wurden auf die Wildtyp-Gruppe normalisiert.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–10, ergänzende Videos 1–3, ergänzende Tabellen 1–8, ergänzende Liste und ergänzende Referenzen.

Ergänzende Liste. Excel-Datei mit vier Registerkarten. Liste S1: Genexpressionsprofil für mRNA-seq-Daten (Informationen zur Genanalyse für erweiterte Daten, Abb. 4a – f); Liste S2: Gesamt-Heatmap-Liste, Top 500 (Genanalyseinformationen für Extended Data Abb. 4e); Liste S3: Antioxidans-bezogene Gene beim Menschen (Informationen zur Genanalyse für Extended Data Abb. 4a – f); und Liste S4: Clusterliste der Expressionsniveaus unter Antioxidans-bezogenen Genen (Informationen zur Genanalyse für erweiterte Daten, Abb. 4f).

Anwenden von Elektrostimulation auf DART-manipulierte Zellen im Inkubator. Eine elektrische Stromquelle wurde verwendet, um 10 s lang eine Gleichspannung von 5 Volt anzulegen. Die Elektrostimulation wurde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt. HEK293-Zellen wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät und mit pJH1003, pJH1004 und pJH1005 transfiziert. Um den Kontrast zu erhöhen, wurde ein weißes Papier unter die Platte gelegt. Die Vertiefungen in der ersten, dritten und fünften Spalte sind die Kontrollgruppen ohne Elektrostimulation und die Vertiefungen in der zweiten, vierten und sechsten Spalte sind die elektrostimulierten Gruppen (DC 5 Volt für 10 s). Die Zellen wurden während des Wiederherstellungsprozesses im Inkubator aufbewahrt.

Fluoreszenzintensitätsaufzeichnung von nicht stimulierten DART-technisch hergestellten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit pJH1003, pJH1004 und pJH1214 (PDART-slGFP-pA) transfiziert. Das Video wurde auf einem Zeiss LSM 980 Airyscan-Mikroskopsystem nach 72-stündiger Kultivierung der Zellen ohne Stimulation aufgenommen.

Fluoreszenzintensitätsaufzeichnung von elektrostimulierten DART-technisch hergestellten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit pJH1003, pJH1004 und pJH1214 (PDART-slGFP-pA) transfiziert. Das Video wurde auf einem Zeiss LSM 980 Airyscan-Mikroskopsystem nach 72-stündiger Kultivierung der Zellen und anschließender 20-sekündiger Stimulation mit 5 Volt Gleichstrom aufgenommen.

Statistische Quelldaten.

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Unbehandelte Western-Blot-Gele.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, J., Xue, S., Buchmann, P. et al. Eine elektrogenetische Schnittstelle zur Programmierung der Genexpression bei Säugetieren durch Gleichstrom. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00850-7

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Eingegangen: 28. April 2023

Angenommen: 23. Juni 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00850-7

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